眼遗传学
第一节分子遗传学大纲要求：
以下内容均要求了解
(1)DNA、基因和染色体
()基因转录
(3)基因翻译
(4)DNA复制
(5)DNA修复
(6)突变与疾病
(7)线粒体基因组
(8)在特定疾病中的基因寻找
(9)对DNA分子的操作法与分析方法
(10)转基因与基因敲除的动物
(11)基因治疗的概念
DNA、基因和染色体
1.DNA是生物的遗传物质，细胞內DNA编码的遗传信息决定了生物体的发育、分化和功能形成。遗传信息的传递是通过细胞核DNA或线粒体DNA。
DNA是一种双螺旋大分子,其基本结构成分为核苷酸水解后产生磷酸、脱氧核糖和碱基。碱基有四种，即腺嘌呤(adenine,A)、鸟嘌呤(guanine,G)、胞嘧啶(cytosine,CO和胸腺嘧定(tymine,T,--种嘌呤和一种嘧啶组成一-对碱基。核苷酸之间以磷酸二酯键相连,形成多核苷酸链。
DNA分子中的碱基排列顺序，储存着遗传信息。三个相邻的碱基顺序构成-一个三联体，转录后每个三联体密码编码某种氨基酸，称为遗传密码(codon)。4种碱基以三联体形式组成一个遗传密码,因此有43=64种密码子，其中有61种编码氨基酸,3种密码子UAA、UGA、UAG不编码任何氨基酸，是肽链合成的终止信号。
.基因(gene)是一种遗传单位，是编码一种蛋白质、rRNA或相关调控序列的一段遗传密码。一个基因的结构包括调控序列(启动子、增强子、终止子)和结构序列(外显子、内含子)，外显子是编码序列，内含子是非编码序列。
3.染色体由DNA和蛋白质组成，每一条染色体都是由一个线性的、完整的、高度螺旋化的DNA分子，加上围绕其中的组蛋白和非组蛋白组成。在细胞间期，染色体伸展开失去超螺旋结构，成为染色质。
基因转录
1.DNA顺序所蕴藏的遗传信息，通过转录(transcription)和翻译形成具有生物活性的蛋白质，从而控制细胞的活动，这个过程称为基因表达。基因对蛋白质的控制并不是由DNA直接进行的，而是通过RNA将遗传信息传递给蛋白质的。
.RNA的基本结构也是由核苷酸连接在一起的链状大分子，与DNA不同的是,它是单链,水解后产生核糖而不是脱:氧核糖，参与组成的碱基有A、U、G、C四种,U代表尿嘧啶(uri-dine),相当于DNA中的T。
3.以DNA为模板，在启动子的控制下，从转录起始点开始，以碱基互补的方式，合成RNA的过程称为转录。转录是DNA模板的方向为3→5.转录产物为5-3.转录产物的碱基顺序与基因的遗传信息致，只是把T换成了U.
转录需要RNA聚合酶的催化。转录产物有3种:信使RNA(mRNA),核糖体RNA(rRNA)和转运RNA(tRNA)。mRNA的原始产物称为核内异质RNA(hnRNA),hnRNA需要经过转录后加工，才能成为多肽链合成的模板。
mRNA的加工包括:
(1)戴帽:在转录过程中，在mRNA5端接上一一个甲基化帽。
()剪接:在酶的作用下,将hrRNA中的内含子切掉，然后将各个外显子按照一定顺序准确拼接起来，成为能编码蛋白质的成熟mRNA。
(3)加尾:mRNA3端在腺苷酸聚合酶的作用下加接一连串腺苷酸,形成多聚腺苷酸(polyA)尾。
4.遗传印记(genomicimprinting)，父母双方的同源染色体或等位基因存在着功能上的差异,不同性别的亲代传给子代的同一染色体或基因，当发生改变时可以引起不同的表型。
基因翻译
1.翻译(translation是指mRNA把转录的遗传信息“解读”，成为多肽链的不同氨基酸顺序的过程，即将mRNA的碱基顺序转变为多肽链的氨基酸顺序。
.翻译是在细胞质的核糖体上进行，tRNA作为转运器，不断把氨基酸转运到细胞质的核糖体上，进行蛋白质的合成。多个核糖体可以同时连接在.个mRNA分子上进行翻译,形成多聚核糖体。翻译后的初始产物需要经过进步的加工修饰,才能成为具有一定生物活性的蛋白质，这个过程称为翻译后修饰。加工的方式有N端脱甲酰基、N端乙酰化、多肽链磷酸化、糖基化及多肽链切割等。
DNA复制
DNA的复制就是基因的复制，通过复制把储存的遗传信息随细胞分裂传递给子代。
DNA的复制是半保留复制，新的子代DNA与原来的DNA完全相同，其中的两条核苷酸链，一条来自亲代DNA分子,另一条是新合成的。DNA复制的方向是按5→3进行的。DNA的两条链都可以作为模板，进行双向复制。
DNA修复
1.DNA始终处于诱变剂如紫外线化学物或自发脱氨基作用的损伤之下，每个细胞每天由于自发性DNA分解就要损失个以上碱基。氧化、烷基化、自由基的产生和其他些常见的代谢反应，也会损伤DNA.如果没有修复，这些突变就会累积起来，导致癌症。人类80%~-90%的癌症是由于DNA突变引起的。
.受损的DNA通过两种机制来实现修复:切除修复和错配修复。切除修复包括碱基切除修复和核苷酸切除修复，通过特异性的核酸内切酶识别受损的DNA部位,在外切酶的作用下切除受损的DNA片段,然后在DNA聚合酶的作用下，以受损片段的互补链为模板合成新的DNA单链片段。
突变与疾病
1.基因突变是指基因组DNA分子某些碱基或其顺序发生变化，突变可以改变单个碱基，或DNA简单地插人或缺失,甚至分子重新排列。基因突变的方式有碱基替换、碱基插人、碱基缺失、碱基重复等。
(1)碱基替换:是指一个碱基对被另个不同的碱基对所替换，替换方式有转换和顛换两种:转换是指-种嘌呤被另种嘌呤所取代，或一种嘧啶被另种嘧啶所取代;颠换是指嘌呤取代嘧啶,或是嘧啶取代嘌呤。碱基替换如果发生在某个基因的编码区内,就会导致mRNA密码子的改变,对氨基酸的合成造成影响，可能出现三种效应:
1)同义突变:碱基替换后,一个密码子变成另-一个密码子,但所编码的氨基酸还是同一种，并不发生表型的改变。
)错义突变:碱基替换后形成了新的密码子，导致多编码的氨基酸发生改变，影响基因产物的功能。
3)无义突变:碱基替换后,使-一个编码氨基酸的密码子变为不编码任何氨基酸的终止密码子中的任何一个，使多肽链的合成提前结束,产生片段缺失、没有活性的多肽片段。
()碱基插人:是在DNA编码序列中插人一个或几个碱基对，从而使插人点下游的DNA编码框架全部改变,结果在翻译水平上引起多肽链的氨基酸顺序和种类发生变化。
(3)碱基缺失:是在DNA编码序列中丢失一个或几个碱基对，也使缺失点下游的DNA编码框架全部发生改变,结果也引起多肽链的氨基酸顺序和种类发生变化。5sluet)
(4)碱基重复:是在基因组中的大量重复序列，在基因的相同位点这些重复序列的变动很大，它们的重复次数在传代过程中也会发生明显的变化,从而表现出遗传多态性。
.癌症可以由遗传机制造成,包括癌基因的激活或抑癌基因的丢失。癌基因是能引起细胞恶性转化的基因,存在于正常人体内,并且是细胞正常生长、分化所必需的，但在机体生长发育过程完成后，多处于封闭状态，即不表达或低表达，一旦在错误的时间、不恰当的地点、不适量地表达，即可能导致细胞无限制增生而趋向恶性转化。癌基因是常染色体显性遗传的，只要-个基因发生突变即可导致肿瘤发生。抑癌基因也是正常细胞中所具有的一类基因,对细胞增殖分化有调节作用，抑制不受限制的细胞增殖。抑癌基因的例子有视网膜母细胞瘤、Wilms肿瘤、神经纤维瘤病I型和I型、结节性硬化、共济失调毛细血管扩张症、vonHippel-Lindau综合征、遗传性非息肉性结肠癌等。抑癌基因形成肿瘤的机制与癌基因不同，只有一对抑癌基因都丧失功能或失活,形成隐性状态后才会失去其抑制肿瘤发生的作用，产生肿瘤。
线粒体基因组
1.线粒体DNA(mtDNA)占到人体细胞DNA总量的0.3%,但只占人类基因组的0.%。它是一个bp的双链闭合环状分子,编码13种蛋白质、种tRNA和种rRNA,这13种蛋白质都是呼吸链酶复合物的亚单位。mtDNA结构紧凑，没有内含子。
mtDNA的突变率是核DNA的10~0倍,原因是缺少组蛋白的保护，线粒体中无DNA损伤修复系统以及线粒体中高浓度氧导致DNA损伤。
.眼球和视觉系统的许多疾病都与线粒体缺失和突变有关。当-种疾病表现为母系遗传时,要考虑线粒体疾病。母系遗传和X连锁遗传表面上相似，但母系遗传的特点是患病女性的所有子代，包括儿子和女儿都患病,但只有女儿将疾病继续传代。
3.mtDNA在有丝分裂和减数分裂时由于突变而使体细胞和生殖细胞同时具有突变型和野生型mtDNA,即杂质性。杂质性细胞随机分离到两个子细胞中的野生型和突变型mtDNA的比例发生变化，氧化磷酸化缺陷与突变型mtDNA的比例成正比。
4.mtDNA具有國值效应,当突变的mtDNA达到一定比例时,产生的ATP低于维持各组织器官正常功能所需的最低值,才会有受损的表现。
5.线粒体疾病分为四类
(1)mtDNA重排(缺失或插人)导致的疾病:如慢性进行性外眼肌麻痹(CPEO)、Kearns-Sayre综合征。
()mtDNA编码的rRNA突变:如母系遗传的神经性耳聋、氨基糖苷诱发的耳聋。
(3)mtDNA编码的tRNA突变:如线粒体肌病脑病伴乳酸中毒及脑卒中样发作(MELAS综合征)、肌阵挛性癫痫伴碎红纤维病(MERRF综合征)。
(4)错义突变和无义突变:如Leber遗传性视神经病。
在特定疾病中的基因寻找
目前有大量手段可用于将各个基因定位在特定染色体，或特定基因之间相互连锁,或疾病与特定基因连锁。
1.共线性同一条染色体上存在的基因，即使相距很远，都具有共线性。X连锁的基因，如红绿色盲、无脉络膜、血友病,肯定是共线性的。这个概念也可用于物种之间的同源染色体区域。例如，鼠的视紫红质基因位于1号染色体的远端，相当于与人的染色体3q共线性。
.细胞生成的标记如果特定的染色体结构发生异常或正常变异，它作为一种遗传性疾病随家系传递，我们可以假设突变基因与变异的染色体是共同传递的，因此突变基因就可以定位于变异的染色体上.
3.基因剂量如果包含特定基因的染色体的一部分缺失了，那么基因产物的量就仅仅取决于剩下的同源染色体。例如，13号染色体长臂部分缺失导致血清中酯酶D只有正常水平的50%,这些患者中又有一-些发生视网膜母细胞瘤，提示酯酶和视网膜母细胞瘤的基因都位于缺失的片段。
4.关联某些疾病之间关系密切可能并不是由于基因在物理学上的关系。经典的关联研究方法是从人群水平上比较疾病组与对照组之间某个位点基因或基因型频率的差异。
5.连锁真核生物遗传过程中会发生减数分裂，此过程中染色体要进行重组和交换,这种重组和交换的频率会随着染色体上任意两个点间的相对距离远近而发生相应的变化。根据这一点,就可以推断出同一条染色体上两点间的相对距离和位置关系。连锁分析就是基于染色体重组基础之上，由标记位点和疾病位点之间的重组率来估算两者间的连锁程度和遗传距离。经典连锁分析采用的是优势对数法(Logoddsscore),又称LODs法，主要检测在两个基因或位点以某重组率相连锁时，出现这种情况的可能性有多大,利用-个家系中所有成员之间的遗传信息，为致病基因选择一个合适的遗传模式MI，将致病基因指定于一个特定的基因座位,另设一一个模型MO，符合无效假设即致病基因与Ml中所沙及的染色体区域无连锁关系。
当LODs3时，说明发生连锁的可能性是不发生连锁的可能性的倍，可以肯定连锁,当LODs1,则支持连锁,LODs-,否定连锁。
6.连锁分析所采用的多态性DNA标记经历了限制性片段长度多态性(RFLP)、可变数量的串联重复序列(VNTR)、单核苷酸多态性(SNP)的发展,特别是VNTR(又称为微卫星mic-rosetellites,短串联重复STR)在基因组内含量丰富，多态信息量理想,并且已经构建完毕,大大加速了孟德尔遗传病的基因定位和克隆。
(1)位置克隆:当连锁分析提示一个基因位于某特定染色体区域时，这个基因可以通过分子遗传学技术分离和克隆出来，这个过程需要用靠近这个基因区域的探针或标记进行连续的精细定位。从这些克隆里找到感兴趣的基因可以通过以下策略:
1)筛查这个区域里已知的人类候选基因。
)筛查与这个区域共线的已知动物基因的同源序列。
3)通过这个区域ESTs的存在或消失寻找微缺失。乐人
4)竞争杂交定位技术。
()候选基因法
1)候选基因筛查:筛查在组织中表达丰富的基因、对组织功能很重要或在某种组织特异性表达的基因突变。有时候选基因就是引起与人类相似疾病动物模型的基因。
)位置候选基因筛查:无论连锁分析将基因定位在哪个染色体片段,在这个区域里的已知基因都将成为候选基因。
对DNA分子的操作法与分析方法
1.DNA文库是用现代DNA重组技术和DNA克隆方法人工构建的、含有基因组全部DNA片段的DNA克隆所组成的库，成千上万携带不同DNA片段的DNA克隆中含有基因组的全部基因。基因组DNA文库是用限制性内切酶消化细胞的DNA所形成的DNA碎片组成的;eDNA文库是采用反转录酶将细胞表达的所有mRNA转录为双链DNA拷贝所组成的。
.重组DNA不同来源的DNA结合在同一个DNA分子上,称为重组DNA,根据需要选择目的DNA片段在体外重组,再用一定的基因转移方法将重组DNA输人另细胞或生物体内，可以达到改良和创新物种和治疗疾病的目的。
3.聚合酶链反应(PCR)聚合酶链反应是在体外迅速选择性扩增特定的靶DNA序列的方法。PCR之前必须事先知道靶DNA序列信息以构建两个寡核苷酸序列作为引物;必须具有4种三磷酸核苷,以5→3方向合成新链;每个周期经过变性、复性和延伸三个阶段倍增DNA,经过n个周期可扩增”倍。
4.分子杂交是鉴定核酸(DNA或RNA)分子的方法，即用标记的核酸探针鉴定碱基序列中密切相关的核酸分子。Southern印迹杂交;将靶DNA分子用一个或多个限制酶消化，通过凝胶电泳分类其大小的不同片段，再变性并转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上杂交。
Northern印迹杂交的靶核酸是RNA，不同类型的组织或细胞的总RNA提取后自凝胶上分类大小,再将分离的RNA转移到膜上用标记的基因探针检测。Western印迹杂交:是在蛋白质水平检测或研究基因表达与功能的方法。
5.突变筛查单链构象多态性(SSCP):双链DNA变性为两条单链后,各自会在中性条件下形成各自塔顶的空间构象，因而在电泳时将在不同的位置出现各自的电泳条带，如果DNA序列发生变化,即使只有一个碱基变化，空间构象也有可能发生变化，电泳条带也随之改变。当被检DNA电泳条带与已知序列的对照DNA条带不一致时，说明被检DNA序列与对照DNA不同。SSCP只能说明有无突变,但不能说明突变的性质,适于大量样本的筛查。
6.变性梯度凝胶电泳法(DGGE)双链DNA通过在梯度浓度的变性剂如尿素甲酰胺中电泳，不同大小和碱基组成的DNA分子达到凝胶中不同位置时发生变性，突变会影响特定DNA分子在凝胶中变性的位置,因而改变迁移的模式。在引物的5端增加40bp左右的GC重复片段(即GC夹),可以增加DGGE检测突变的敏感性。
7.直接测序DNA的快速测序是分子生物学的一大进步，低廉的价格以及省时、高效、准确的特点，可以迅速从cDNA中发现突变，而基因组的测序要复杂和费时一一些。
8.限制性内切酶如果点突变正好破坏或创造了-个限制性酶切位点，这个突变很容易通过可识别限制性位点的特异性内切酶筛查出来。
9.等位基因特异性寡核苷酸(ASO)杂交合构建ASO探针,从序列上跨越变异的核苷酸位点,杂交时，只有在探针和靶DNA双链间的碱基完全互补时，两者间的单个错配才足以表达出此异源双链的不稳定性。
转基因与基因敲除的动物
1.转基因动物是采用显微注射方法将所要研究的基因注人受精卵的雄原核,再将其受精卵植人假孕动物体内,使其生长发育并繁殖新生代,然后用分子生物学方法从新生代中筛选出基因组中整合了导人基因的动物。转基因动物被引入新的遗传物质整合到基因组里，与正常基因一起复制并传递给下一代。转基因动物因为转人了正常基因的拷贝而可以治愈某些常染色体隐性遗传疾病。转基因动物也可以携带引起常染色体显性遗传疾病基因，而成为某种疾病的动物模型。
.基因敲除动物是一种破坏特定基因功能的特殊的动物品种，主要用于确定缺乏某种正常基因产物后的表现型。基因敲除技术可用于制作常染色体隐性遗传疾病的动物模型。制备基因敲除动物必须具备:①胚胎干细胞分离技术的成功,并证实这种细胞还能重新加入处于胚胎阶段的发育;②外源DNA可以与内源DNA的同源区域之间发生重组，也称基因打靶;
③可将存在于胚胎干细胞中的突变基因引入活体细胞,并向后传代;④正负选择系统的应用使胚胎干细胞中的内源基因的定位突变在技术上可行。
基因治疗的概念
1.基因治疗是指运用DNA重组技术设法修复患者细胞中有缺陷的基因，使细胞恢复正常功能以治疗遗传病。
.将外源基因安全有效地转移到靶细胞内是基因治疗的关键，具体方法有物理方法(包括直接注射法、电穿孔法微粒子轰击法)、化学法、膜融合法、通过受体载导转移目的基因、同源重组法和病毒转移法,其中以病毒作为目的基因的载体是目前最有效的转移基因方法。当前应用最广泛最成功的是反转录病毒，除此外备受