本文原载于《中华眼科杂志》年第5期
外斜视是儿童眼科常见病，该病除了影响患者的面部美观，使患者产生不良的心理问题外，更为严重的是对儿童双眼视功能发育产生严重影响。其治疗方法仍以手术为主，但传统手术不但使患者承担一定的手术风险。而且，手术具有个体差异，远期效果也不稳定，术后复发率高。因此，探寻替代手术治疗的药物成为斜视治疗的另一研究方向。胰岛素样生长因子Ⅰ（insulin-likegrowthfactorⅠ，IGF-Ⅰ）是一种多功能的肌源性生长因子，具有提高骨骼肌肌力，促进骨骼肌增生，加速受损骨骼肌的恢复等作用。研究表明，外源性IGF-Ⅰ对成熟及生长中的眼外肌都具有增强作用，并且无全身及局部毒性作用。而这个病理变化过程中，影响肌卫星细胞的某些因子和蛋白的表达可能也发生了改变，如肌分化因子5（myocytedifferentiationfactor5，Myf5）、转化生长因子β1（transforminggrowthfactorβ1，TGF-β1）。但上述的研究只局限于正常的眼外肌，是否参与肌萎缩减轻过程仍不清楚。
本研究通过制作外斜视猫模型，经外源性IGF-Ⅰ干预后，采用免疫组织化学法观察内直肌Myf-5、TGF-β1表达变化的影响及时间相关性，探讨IGF-Ⅰ能否抑制或减轻实验性外斜视猫内直肌的萎缩过程，为斜视药物治疗可行性从理论上提供新的思路和方法。
材料与方法
一、实验动物
市购健康清洁级幼猫27只，4~6周龄，雌雄不限，体重g左右。经常规检查排除幼猫双眼外眼、屈光间质及眼底异常。
二、实验方法
1．动物模型制作与分组：
所有幼猫在氯胺酮（25~40mg/kg）全身麻醉下，行右眼外直肌缩短并前徙制作外斜视模型，缩短约5mm，具体方法见课题组前期研究[1]。在前期研究中，通过角膜映光位、动物行为（觅食时无法准确定位食物以及走路呈蹒跚状态等）以及眼外肌病理变化判断外斜视建立成功与否[1]。外斜视模型建立后，即刻采用随机数字表法随机选取9只，在其内直肌注射IGF-Ⅰ0.05ml（0.1g/L）作为实验组。具体注射方法：开睑器开睑，用镊子将第3眼睑中央相对应的角膜缘固定，并稍拉向颞侧，助手用镊子将第3眼睑提起，充分暴露鼻侧球结膜，用微量注射器在距内侧角膜缘5mm处进针，并沿巩膜弧度向下潜行约10mm，每次注射是均用量尺测量，记录注射点距肌止端的距离，尽量保持一致的距离。同时，应用随机数字表法随机选取9只作为无菌水对照组，即上述方法注射等量无菌水；剩余9只作为空白对照组（未进行注射）。
实验组又根据IGF-Ⅰ干预时间的不同分为4周亚组、8周亚组和12周亚组，每亚组各3只（每2周注射1次）；无菌水对照组和空白对照组亦进行相同时间分组。各组幼猫在药物干预不同时间点用巴比妥钠处死后，立即获取完整右眼内直肌。
2．免疫组织化学染色方法：
将眼内直肌组织用显微手术剪剪成约4mm×4mm×2mm大小后立即置于4%甲醛中性固定液中，4℃下固定24h，梯度乙醇常规脱水，二甲苯透明，石蜡固定包埋。常规脱蜡，蒸馏水冲洗，PBS浸泡5min；微波抗原热修复；3%双氧水室温下孵育20min；血清封闭15min；滴加一抗Myf5（1∶）、TGF-β1（1∶）置湿盒于4℃冰箱内过夜，PBS冲洗；滴加二抗，37℃孵育15min，PBS冲洗；DAB显色，蒸馏水浸泡；苏木素复染：梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。HE染色：将包埋好的蜡块，按以下步骤进行操作：（1）二甲苯常规脱蜡，梯度乙醇浸泡水洗；（2）苏木素染色5min，蒸水冲洗；（3）盐酸乙醇分化30s；（4）蒸馏水浸泡15min；（5）置于伊红液中2min；（6）对切片常规进行脱水，透明，封片。将光学显微镜调至倍后观察Myf5和TGF-β1免疫组化切片并照相。每张切片采用简单随机抽样方法随机拍摄5个不重叠的视野，采用Imagepro-Plus6.0软件测量每张Myf5切片照片中肌细胞胞核中Myf5的平均吸光度（A）值和每张TGF-β1切片照片中细胞胞质TGF-β1的A值。光镜下肌细胞胞核中棕黄色的颗粒即为Myf5阳性表达，阳性对照选取横纹肌肉瘤标本切片，阴性对照选取正常猫内直肌切片用PBS代替一抗。光镜下细胞外基质中棕黄色的颗粒即为TGF-β1的阳性表达，阳性对照用人恒定性外斜视内直肌切片，阴性对照正常猫的内直肌切片用PBS代替一抗。计算其均数作为每份标本的A值。
3．HE染色：
观察实验组、无菌水对照组和空白对照组眼内直肌组织炎性变化。（1）包埋好的蜡块用二甲苯常规脱蜡，经梯度乙醇浸泡后水洗；（2）苏木素染色5min，蒸水冲洗；（3）盐酸乙醇分化30min；（4）蒸馏水浸泡15min；（5）置于伊红液中2min；（6）对切片常规进行脱水，透明，封片。
三、统计学分析方法
采用SPSS17.0分析软件，经正态性检验和方差齐性检验后通过Kruskal-Wallis检验比较各组间Myf5和TGF-β1表达的差异，两组间比较采用Bonferroni检验。采用简单线性回归分析对Myf5和TGF-β1的表达与外斜视猫治疗模型药物干预时间进行相关分析。Bonferroni检验以P0.为差异有统计学意义，余统计学方法以P0.05为差异有统计学意义。
结果
一、内直肌Myf5的表达
药物干预4周时，实验组、无菌水对照组和空白对照组内直肌中Myf5的表达量（A值）分别为33.34±17.16、21.30±7.44、18.95±6.59，经Kruskal-Wallis检验，χ2=4.，P=0.，各组间表达差异无统计学意义。药物干预8周时，实验组内直肌中Myf5的表达量（39.24±15.25）较无菌水对照组（19.43±4.75）和空白对照组（18.00±7.29）均增多，经Kruskal-Wallis检验，χ2=21.，P0.01；进一步经Bonferroni校正（以P0.为差异有统计学意义），除无菌水对照组与空白对照组差异无统计学意义（P=1.）外，实验组与无菌水对照组、实验组与空白对照组两组间Myf5的表达差异均有统计学意义（P=0.、P=0.）。药物干预12周时，实验组内直肌中Myf5的表达量（47.70±19.39）较无菌水对照组（4.82±2.66）和空白对照组（5.86±2.61）均增多，经Kruskal-Wallis检验，χ2=31.，P0.01；进一步经Bonferroni校正，除无菌水对照组与空白对照组差异无统计学意义（P=0.）外，实验组与无菌水对照组、实验组与空白对照组两组间Myf5表达差异均有统计学意义（P=0.、P=0.）（图1）。
简单线性回归分析显示，实验组Myf5的表达（Y1）随着IGF-Ⅰ干预时间（X）的延长呈增加趋势，回归方程式为Y1=1.79X+25.69（R2=0.99，F=.63，P0.05）；无菌水对照组（Y2）及空白对照组（Y3）Myf5的表达随时间延长呈降低趋势，回归方程式分别为Y2=-2.06X+31.66（R2=0.81，F=34.73，P0.05）；Y3=-1.64X+27.36（R2=0.80，F=28.56，P0.05）。
二、内直肌TGF-β1的表达
药物干预4、8、12周时，实验组内直肌中TGF-β1的表达（A值：0.80±0.12、0.53±0.09、0.42±0.08）均低于无菌水对照组（1.91±0.23、2.30±1.03、1.82±0.72）及空白对照组（2.01±0.31、2.62±1.11、1.83±0.67），经Kruskal-Wallis检验，χ2=30.，P0.01；χ2=40.，P0.01；χ2=35.，P0.01，差异均有统计学意义。进一步经Bonferroni校正，药物干预4、8、12周时除无菌水对照组与空白对照组间差异无统计意义外（P=0.、P=0.、P=1.），实验组与无菌水对照组、实验组与空白对照组两组间TGF-β1表达差异均有统计学意义（均P=0.）（图2）。
简单线性回归分析显示，实验组内直肌TGF-β1的表达（Y4）随着IGF-Ⅰ干预时间（X）延长呈降低趋势，回归方程为Y4=－0.X+0.95（R2=0.83，F=33.70，P0.05），无菌水对照组及空白对照组TGF-β1的表达回归模型拟合度差，与干预时间无相关性（R2=0.04，R2=0.06）。
三、内直肌光学显微镜下HE染色观察
眼内直肌经HE染色在光镜下可见，实验组肌肉纤维排列较紧密、整齐、方向一致、边界清晰，炎症细胞浸润与无菌水对照组及空白对照组相比未见明显增多（图3）。
讨论
作为一种肌源性生长因子，IGF-Ⅰ可通过调控肌卫星细胞的增殖和分化促进骨骼肌增生，提高骨骼肌肌力及加速损伤骨骼肌的修复[2]。作为特殊骨骼肌类型的眼外肌，IGF-Ⅰ以及IGF-Ⅰ受体在其内终身表达[3]，在维持眼外肌肌纤维不断重塑中发挥重要作用[4]。在外斜视内直肌中，IGF-Ⅰ活性表达明显低于正常眼外肌[5]。本研究以外斜视猫模型为研究对象，选用外源性IGF-Ⅰ作为研究药物，旨在模拟IGF-Ⅰ对外斜视儿童眼外肌的影响。外斜视猫模型已在本课题组前期研究中建立并得以验证[1]，通过观察外斜视猫模型内直肌病理组织学变化发现内直肌发生了肌萎缩改变及相关因子的变化，在此基础上，将外源性IGF-Ⅰ注射到外斜视猫模型弱侧肌，即内直肌。Anderson等[6]通过将外源性IGF-Ⅰ注射到成年兔上直肌后发现眼外肌肌力以及肌纤维横截面积均有明显增加。此外，Chen和von[7]还将外源性IGF-Ⅰ注射到幼年鸡的上直肌和上斜肌，结果发现眼外肌肌力和肌纤维横截面积都有显著增加，证明外源性IGF-Ⅰ对发育中的眼外具有增强作用，并阐明其可以作为未来作为斜视药物治疗的一种手段。以上结果为本研究药物注射的可行性提供了理论依据。但值得注意的是，上述研究仅局限于正常眼外肌，对于外源性IGF-Ⅰ能否在共同性外斜视弱侧肌的病理组织学变化中发挥作用，能否减轻肌萎缩的过程目前仍不清楚。
研究结果发现，斜视患者眼外肌发生了明显的病理改变，这些病理性改变主要以肌纤维萎缩、退行性变化以及某些细胞外基质生成与分解紊乱为主，如肌细胞减少、肌球和肌动蛋白表达减少以及纤维连接蛋白减少等[8,9,10,11]，即临床及研究中所说的弱侧肌。研究结果还发现，该病理变化与某些蛋白、因子的密切相关[12]。其中，Myf5在眼外肌中的表达呈持续状态，维持对活性肌卫星细胞的诱导，而在外斜视弱侧肌中，Myf5的表达则降低[13]。本课题组在前期关于共同性外斜视猫模型内直肌病理组织学研究中，同样得出Myf5的表达量较对照组降低的结果[1]。而在眼外肌Myf5的高表达研究中发现，原发性功能亢进的下斜肌中肌卫星细胞Myf5阳性表达率明显高于健康人[14]。因此，推测Myf5表达量的高低与活性肌卫星细胞的数量相关，可以作为活性肌卫星细胞的标记蛋白[15]。本研究发现，8周和12周实验组外斜视猫内直肌Myf5表达量较对照组均有升高，差异具有统计学意义。推测可能是外源性IGF-Ⅰ使活化的肌卫星细胞增多，导致活化肌卫星细胞中Myf5等因子表达总量增多，Myf5的表达则进一步诱导更多活化肌卫星细胞分化为成肌细胞，以抑制外斜视病理过程中的肌萎缩。而4周实验组与其对照组相比升高不明显，差异无统计学意义，推测可能是病变早期无菌水对照组及空白对照组Myf5反应性升高的缘故[1]。研究还发现，实验组外斜视猫内直肌Myf5的表达量在12周内随着药物干预时间的延长呈增加趋势，而对照组Myf5表达量则随着斜视时间的延长呈降低趋势，表明多次药物注射可持续有效地激活肌卫星细胞的数量。
外斜视弱侧肌除了肌纤维萎缩、退行性改变以外，还会出现不同程度的纤维化、玻璃样变等细胞外基质的改变[16]，TGF-β1则是一种重要的致纤维化因子，主要通过自分泌环路机制启动并调节多种组织器官的纤维化形成与发展过程[16,17]。研究发现，TGF-β1可使肌卫星细胞分化为肌成纤维细胞，进而生成大量胶原纤维，导致骨骼肌纤维化[18]。国内有学者通过研究发现，共同性外斜视弱侧肌中TGF-β1的阳性表达明显高于对照组的眼外肌，说明TGF-β1对共同性外斜视的病理变化过程起到了促进作用[16]。本研究发现，所有实验组外斜视猫内直肌中TGF-β1的表达量较对照组均明显降低，并随药物干预时间的延长呈下降趋势。推测外源性IGF-Ⅰ可能参与了对TGF-β1的抑制过程，使TGF-β1表达降低，从而减少了对肌卫星细胞向成肌纤维的诱导[18]，并且外源性IGF-Ⅰ持续作用可能减轻了眼外肌纤维化的进程，但该过程的具体机制以及传导通路目前尚不清楚。
在有关药物安全性的研究中，有学者认为多次骨骼肌注射IGF-Ⅰ可导致局部出现炎性反应[19]，也有学者通过研究发现单次局部注射IGF-Ⅰ对眼球及眼外肌无明显不良反应，无明显致炎性，认为局部应用该药是安全的[20]。本研究中，局部注射IGF-Ⅰ1周后观察斜视猫注射部位炎症细胞浸润与对照组相比未见明显增多。取眼外肌时观察注射部位附近的巩膜和相应的色素膜也未见明显炎性变化，通过光镜下观察实验组、无菌水对照组和空白对照组眼外肌HE染色组织切片后均未发现明显的炎症细胞浸润，其结果与许金玲等[20]报道一致，但本研究并未观察弱侧肌以外组织的病理改变，对IGF-Ⅰ的局部安全性仍需要进一步探索。另外，光镜下观察眼外肌的组织学形态发现实验组眼外肌排列较对照组整齐，但并未出现过度肥大，倘若在治疗12周后继续给予药物，是否会引起眼外肌过度肥大尚需进一步研究。
为使外源性IGF-Ⅰ有效作用于内直肌，本研究注射的单次剂量为5μg，且每隔2周注射1次。Anderson等[6]对成年兔上直肌分别单次注射1、5、10、25、50μg的IGF-Ⅰ，1周后发现所有注射IGF-Ⅰ的眼外肌较生理盐水对照组肌力显著增强、平均肌纤维横截面积增大，其中以10μg和25μg剂量组效果最显著。许金玲等[20]在相关研究中单次注射采用了10μg的剂量。也有学者采用5μgIGF-Ⅰ剂量同样取得显著效果[7]。本研究旨在观察IGF-Ⅰ对外斜视弱侧肌是否产生影响，尚处于初步阶段，未涉及具体量效问题，故采用5μg分次注射的方法进行。有研究表明IGF-Ⅰ对眼外肌的作用能持续2周左右[6]，因此，本研究每2周给药1次以保证药物持续作用于眼外肌。
判断药物对增强外斜视弱侧肌是否有效，治疗过程中观察角膜映光位以及动物行为（觅食时无法准确定位食物以及走路呈蹒跚状态等）等具有重要意义。本研究也发现经治疗后斜视猫模型眼位有所恢复，异常的动物行为有所改善。但对于动物来说，这些变化目前尚无科学的量化指标，且研究期较短，故即使有明显变化也缺乏有力依据。而且，本研究主要研究药物干预后眼外肌的病理改变，故未把眼位及动物行为作为此次研究的指标。今后，研究组将会随病理组织变化研究的成熟，逐步研究药物对眼位等体征变化的影响。
目前，国内外关于IGF-Ⅰ作用于斜视弱侧肌的研究甚少。本课题组通过研究发现，具有成肌作用的Myf5的表达量升高，而致纤维化因子TGF-β1的表达量降低，表明外源性IGF-Ⅰ对眼外肌纤维能增强其功能，而对纤维化萎缩过程则起到抑制作用，且可以通过重复注射产生持续有效的作用，为将来IGF-Ⅰ治疗斜视的深入研究提供了理论依据。但本研究仍有不足之处：（1）本研究样本量较少，使统计结果说服力减弱。（2）由于没有对模型眼位及动物行为的量化指标，同时研究期较短，尚未具体研究外斜视猫药物治疗期间眼位等体征的变化。（3）尚未对药物的量效、给药方法等做深入研究。本课题组将在今后的实验中克服以上不足，进行更加深入而全面的研究，为斜视药物治疗的研究提供更多的理论依据。
参考文献
预览时标签不可点